T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒

T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)

本試劑盒是基于 T7 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，它利用含有 T7 啟動子的模版 DNA，以 NTP 為底物，從 T7 啟動子下游開始合成與模版 DNA 中一條鏈互補(bǔ)的 RNA，簡單快速獲得大量的 RNA 分子。本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：

1. 即開即用，用戶只需提供含T7 啟動子的DNA模板即可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)， 不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每一個(gè)成份。

2. 單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復(fù)性。

3. 模版 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。

4. 可以合成的 RNA 的最佳長度在 20nt 到 2000 nt 之間。

5. 產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化，每 ug DNA 模版可以合成 2-6 ug RNA。

6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結(jié)構(gòu)研究、核酶生物化學(xué)、體外翻譯、RNA-蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX 技術(shù)和 RNA 干擾（RNAi）等實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒足夠 50 次 20uL 體系的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存

低溫運(yùn)輸，-20℃保存、有效期一年。

自備試劑

Tris 飽和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇(均可從本公司另購)

相關(guān)資料

一、制備 DNA 模板（本試劑盒不含所需試劑，此處信息僅供參考）

PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾點(diǎn)。

一是必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切成線狀。

二是需要轉(zhuǎn)錄的DNA 序列的上游必須有T7 啟動子。如果模板是 PCR 產(chǎn)物， 則可以在設(shè)計(jì)引物時(shí)將 T7 啟動子序列（5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’）加上。如果是將 DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T7 啟動

子的載體，并且克隆位點(diǎn)必須位于 T7 啟動子下游。

三是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的下游端最好不要是 3’突出。如果是 3’突出

（比如選擇了 Pst I 來線性化質(zhì)粒），則最好用 T4 DNA 聚合酶修平。

四是必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質(zhì)粒 DNA 的過程中一般要使用大量的 RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴(yán)重的 RNase A 污染， 所以在用作模板前，最好采取膠回收得方法回收質(zhì)粒 DNA。并且加入少量總RNA 一起保溫，然后電泳檢測 RNA 是否被降解，以此來判斷純化的 DNA 模板是否有殘留 RNase A。如果有 RNase 污染，則必須反復(fù)酚-氯仿抽提去除殘留的 RNase，然后再乙醇沉淀質(zhì)粒 DNA。

二、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

1.在兩個(gè) RNase-free 的塑料離心管中，在室溫下（不是在 4℃下）分別按次序加入下列成分（T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液容易產(chǎn)生結(jié)晶沉淀，一定要握在手中直到結(jié)晶che底溶解并搖勻后方可使用）：

注：此為 20uL 反應(yīng)體系的用量，對其他反應(yīng)體系，各成分的用量可以按比例增減。本產(chǎn)品的 T7 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液已經(jīng)含有NTP。如果需要標(biāo)記 RNA 探針，則需要訂購 NTP 分開的試劑盒。如果需要得到加帽 RNA，則需要加入自備的加帽修飾核苷酸（NEB 公司有此產(chǎn)品）。

2.37℃保溫 1-2 小時(shí)。注意：延長保溫時(shí)間并不能提高產(chǎn)量。

3.70℃加熱 10 分鐘滅活 T7 RNA 聚合酶。

4. 取 1-3 uL 電泳檢測轉(zhuǎn)錄效果。一般 1 ug DNA 可以合成 5-10 ug 的 RNA。

5.得到的 RNA 可以放-80℃保存。如需去除 DNA 模板，請按下面步驟操作。

三、去除 DNA 模板（所需試劑需要另購）

1.在體外轉(zhuǎn)錄體系中加入 1 uL 自備的 RNase-free DNase （3-5 U/uL）。

2.37℃保溫 15-30 分鐘。

3.補(bǔ)水到 100 uL。

4.用自備的等體積（100 uL）的 Tris 飽和酚-氯仿抽提一次去除殘留的 DNase和 RNA 聚合酶。

5.加自備的 200 uL 無水乙醇，振蕩后 15000 rpm 離心 20-30 分鐘，棄上清（含 NTP 和鹽離子等成分）。

6.加入 1 mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。

7.短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。

8.晾干，所得沉淀即體外轉(zhuǎn)錄所得的 RNA?？扇苡?RNase-free 水中后立即使用或放-80℃長期保存。

疑難解答

1、沒有 RNA 產(chǎn)物。最常見原因是模板有 RNase 污染，可用純化的 RNA 跟模板 DNA 一起保溫，再檢測 RNA 是否降解。還可以增加 RNase Inhibitor用量，本試劑盒緩沖液和酶混合液中有 RNase inhibitor，如果模板 RNase污染嚴(yán)重，可能需要用戶補(bǔ)加 RNase inhibitor。

2、RNA 產(chǎn)量低。最常見的原因是 DNA 模板。在轉(zhuǎn)錄序列的第一個(gè)和第二個(gè)堿基最好都是 G，在前 14 個(gè)堿基內(nèi)避免有 U 存在。

3、RNA 長度比預(yù)期的短。可能是模板序列中有 T7 RNA 聚合酶的終止序列。可以改用 SP6 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（啟動子也必須改成 SP6 啟動子）。

4、RNA 長度比預(yù)計(jì)的長。T7 RNA 聚合酶跟 Taq DNA 聚合酶一樣，有不依賴于模板的加尾功能，最多有一半的 RNA 可以帶一個(gè)或兩個(gè)堿基的尾巴。如果 RNA 長度比預(yù)計(jì)的長很多，使用的模板又是質(zhì)粒 DNA，則可能是質(zhì)粒DNA 線性化不che底。

5、5’單磷酸還是三磷酸。如果使用 GTP，則得到的 RNA 是三磷酸，體外轉(zhuǎn)錄時(shí)如果保溫時(shí)間太長（如 12 小時(shí)），則有 50%的三磷酸會變成單磷酸。如果在轉(zhuǎn)錄體系中加入 GMP，則 T7 RNA 聚合酶將優(yōu)先使用 GMP，所得RNA 產(chǎn)物中 5’端是單磷酸的比例將大大增加。

6、用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒如何得到帶帽 RNA？

7、需加入帶帽 NTP 類似物即可。

T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒僅供科研實(shí)驗(yàn)！