鴨瘟病毒(DPV)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：鴨瘟病毒(DPV)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)

Name ：Duck Plague Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

鴨瘟，又稱鴨病毒性腸炎，是由皰疹病毒科鴨瘟病毒（Duck Plague Virus, DPV） 引起的一種急性（有時呈慢性）鴨、鵝和天鵝接觸性傳染病。其特征為體溫升高，兩腿麻痹，下痢，流淚和部分病鴨頭頸腫大。食道粘膜有小出血點，并有灰黃色假膜覆蓋或潰瘍，泄殖腔粘膜充血出血水腫和假膜覆蓋。肝有不規(guī)則大小不等的出血點和壞死灶[1]。本病傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重威脅養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展。

本試劑盒適用于檢測病鴨血液、口腔偽膜及潰瘍處粘液、肝、脾、腎等組織樣品   等樣本中的鴨瘟病毒，用于鴨瘟病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

鴨瘟病毒(DPV)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)對鴨瘟病毒基因組保守區(qū)設(shè)計特異性引物和探針[1-3]，用熒光 PCR 技術(shù)對鴨瘟病毒的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

1）  不同批號試劑不能混用。

2）  試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列

熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

在發(fā)病早期，無菌采集病鴨血液或刮取口腔偽膜及潰瘍處粘液；在動物死亡后，

無菌采取肝、脾、腎等組織樣品

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標(biāo)本

運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.  樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1  樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)/剪剪碎混勻后取0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；粘液直接取 100μL 提取

1.2 DNA 提取

推薦采用公司生產(chǎn)的 DNA/提取試劑盒（離心柱提取

法），請按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.  試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.  加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.  PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye） NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38， 且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.  質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

7.  檢測方法的局限性

? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

? 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定   量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

? 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。