禽腺病毒 D 型(FADV-D)核酸檢測試劑盒說明書

【產品名稱】

禽腺病毒 D 型(FADV-D)核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

商品名稱：禽腺病毒 D 型(FADV-D)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法) 

Name：Fowl Adenovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預期用途】

禽腺病毒 D 型(Fowl Adenovirus, FADV-D)是無囊膜、線性雙股 DNA 病毒,屬于腺病毒科、禽腺病毒 D 型屬成員。該病毒可感染雞、火雞及其他禽類。FADV-D 可致雞發(fā)生包涵體肝炎、心包積水綜合征和肌胃糜爛等疾病。該病常與禽類其他病原混合感染,感染雞只可繼發(fā)再生障礙性貧血、肝炎及產蛋量下降等。FADV-D 呈世界性分布,病毒可經糞-口途徑水平傳播,也可垂直傳播,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經濟損失。

本試劑盒適用于檢測呼吸道分泌物棉拭子（感染 I 群禽腺病毒 D 型的雞、火雞、鵝、鵪鶉）、卵巢、輸卵管、卵泡、子宮和輸卵管粘膜組織、泄殖腔拭子（感染 II、III 群禽腺病毒 D 型的雞、鴨）等樣本中的禽腺病毒 D 型，用于禽腺病毒 D 型感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計一對禽腺病毒 D 型特異性引物，結合一條特異性探針[1]，用熒光 PCR 技術對禽腺病毒 D 型的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

FADV-D 反應液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

FADV-D 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死禽取卵巢、輸卵管、卵泡、子宮和輸卵管粘膜組織；活雞取呼吸道拭子或泄殖腔拭子，放于 1mL 50%

甘油生理鹽水中

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后，于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；泄殖腔拭子直接取 100μL 提取。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，   請按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

試劑FADV-D 反應液酶液

用量（樣本數為 N）19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇：檢測通道（ReporterDye）FAM，淬滅通道（QuencherDye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX

參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數設置：

步驟循環(huán)數溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應結束后自動保存結果，根據分析后圖像調節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據實際情況自行調整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數期，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質控標準

陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

3.陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1]文艷玲,禽腺病毒 D 型 hexon 基因克隆表達及間接 ELISA 和熒光 PCR 檢測方法的建立[J].廣西大學,2008.