鴨瘟病毒(DPV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：鴨瘟病毒(DPV)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

Name ：Duck Plague Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

鴨瘟，又稱鴨病毒性腸炎，是由皰疹病毒科鴨瘟病毒（Duck Plague Virus, DPV） 引起的一種急性（有時呈慢性）鴨、鵝和天鵝接觸性傳染病。其特征為體溫升高，兩腿麻痹，下痢，流淚和部分病鴨頭頸腫大。食道粘膜有小出血點，并有灰黃色假膜覆蓋或潰瘍，泄殖腔粘膜充血出血水腫和假膜覆蓋。肝有不規(guī)則大小不等的出血點和壞死灶[1]。本病傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重威脅養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展。

本試劑盒適用于檢測病鴨血液、口腔偽膜及潰瘍處粘液、肝、脾、腎等組織樣品   等樣本中的鴨瘟病毒，用于鴨瘟病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒對鴨瘟病毒基因組保守區(qū)設(shè)計特異性引物和探針[1-3]，用熒光 PCR 技術(shù)對鴨瘟病毒的核酸進(jìn)行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

名稱規(guī)格

酶液50μL×1 管

DPV 反應(yīng)液500μL×2 管

DPV 陽性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

注：

1）不同批號試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列

熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

在發(fā)病早期，無菌采集病鴨血液或刮取口腔偽膜及潰瘍處粘液；在動物死亡后，

無菌采取肝、脾、腎等組織樣品

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標(biāo)本

運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；粘液直接取 100μL 提取

1.2DNA 提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取

法），請按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑DPV 反應(yīng)液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）20μL1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye） NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃10min否

240 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38， 且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

7.檢測方法的局限性

?樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

?樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

?陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

?病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

?不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

?試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定   量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

?本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

?所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

?試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完-全混勻并短暫離心；

?反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

?反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

?使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

?樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

?實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

?試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通   則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. SN/T-2744-2010 鴨病毒性腸炎檢疫技術(shù)規(guī)范[S]. 北京: 科學(xué)出版社, 2010.

[2]索化夷, 湯承, 岳華, 等. 實時熒光定量TaqMan-PCR 檢測鴨瘟病毒方法的建立[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2006.

[3]馬騰飛. 鴨瘟病毒熒光定量 PCR 檢測方法的建立及其強弱毒株 UL2 基因差異分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.