雞馬立克病毒（MDV）核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒（熒光-PCR 法）說(shuō)明書(shū)

雞馬立克病毒（MDV）核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒（熒光-PCR 法）

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：雞馬立克病毒（MDV）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光-PCR 法）

Name ：Marek's Disease Virus Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

雞馬立克氏病是由雞馬立克氏病病毒引起的一種雞的惡性淋巴腫瘤性疾病，屬于α皰疹病毒屬，具有高度的接觸傳染性。ＭＤ以淋巴細(xì)胞組織增生，在各內(nèi)臟器官以及外周神經(jīng)、肌肉、皮膚、性腺、虹膜中產(chǎn)生單核細(xì)胞浸潤(rùn)和腫瘤為特征[1-2]。ＭＤ 在世界各地廣泛流行，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)該病也是目前唯-一可以用疫苗來(lái)預(yù)防的腫瘤性疾病。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光 PCR 原理，檢測(cè)馬立克氏病病毒， 對(duì)雞馬立克氏病的診斷有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)馬立克病毒基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系   中含馬立克病毒基因組模板的情況下，PCR 反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì) PCR 過(guò)程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性、定量分析。

【試劑組成】

名稱規(guī)格

核酸提取液1.5mL×2 管

酶液50μL×1 管

MDV 反應(yīng)液1.0mL×1 管

MDV 陽(yáng)性質(zhì)控品50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

注：

1）不同批號(hào)試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

剪取腫瘤組織、病變淋巴結(jié)組織。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 50μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；

1.2DNA 提取

1）對(duì)上述處理好的標(biāo)本加入 50μL 核酸提取液，100℃恒溫處理 10min，13,000 rpm 離心 5min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5mL EP 管，-20℃保存；

2）DNA 的提取也可以采用公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑MDV 反應(yīng)液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）20μL1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye） NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間收集熒光信號(hào)

11 cycle95℃10min否

240 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.15.2 結(jié)果判斷

陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線；

可疑：檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤38， 且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線，判定為陽(yáng)性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。

6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無(wú) Ct 值顯示；

陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

7.檢測(cè)方法的局限性

?樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

?樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；

?陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；

?病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

?不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

?試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定   量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

?本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

?所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；

?試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，wan全混勻并短暫離心；

?反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

?反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

?使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

?樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

?實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

?試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通   則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Abdul-Careem M F, Read L R, Parvizi P, et al. Marek's disease virus induced expression of cytokine gene in feather of genetically defined chickens [J]. Dev Comp Immunol, 2009, 33(4): 618-623.

[2]Davison A J, Eberle R, Ehlers B, et al. The order herpes virales [J]. Arch Virol, 2009(154):171-177.