總抗氧化能力 (ABTS 法)試劑盒說明書

總抗氧化能力 (ABTS 法)試劑盒說明書

微量法 100T/96S

注　意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

研究意義：

測定對象中各種抗氧化物質和抗氧化酶等構成總抗氧化水平。在生物學、醫(yī)學和藥學研究中常常檢測血漿、血清、唾液、尿液等各種體液，細胞或組織等裂解液、植物或中草藥抽提液及各種抗氧化物(antioxidant)溶液的總抗氧化能力。

測定原理：

ABTS 法是使用Z廣泛的間接檢測方法，可用于親水性和親脂性物質抗氧化能力測定。ABTS經氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基 ABTS+，能溶于水相或酸性乙醇介質中，在 734nm 處有最大吸收。被測物質加入 ABTS+溶液后，所含抗氧化成分能與 ABTS+發(fā)生反應而使反應體系褪色。在 734nm 檢測吸光度的變化，并以 Trolox 作為對照體系量化抗氧化物質的抗氧化能力。

自備實驗用品：

恒溫水浴鍋、低溫離心機、酶標儀、96 孔板和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 120mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 24mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：粉劑×2 瓶，4℃避光保存。

樣品的制備：

(1)     血清、血漿、唾液或尿液等液體樣品

血漿（制備時可以使用肝素或檸檬酸鈉抗凝，不宜使用 EDTA  抗凝）4℃，5000rpm 離心

10min，取上清待測。血清、唾液或尿液樣品直接用于測定，也可以-80℃凍存（不宜超過

30   d）后再測定。

(2) 組織樣品

按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）進行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

(3) 細胞樣品

按照細胞數量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎（功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；10000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

操作步驟：

1、 酶標儀預熱 30min，調節(jié)波長至 734nm。

2、 工作液的配置：臨用前取試劑二一瓶，加入 11mL 試劑一，震蕩混勻 20min 后，靜置，

取上清使用。（注意，現配現用）

3、操作表（在 EP 管中反應）

充分混勻，10min 內測定 734nm 吸光值，△A= A 空白-A 測定

注意：空白管只需測定一次，吸取工作液時不要吸到底部沉淀，若 A 測定小于 0.4，需用提取

液稀釋后檢測。

總抗氧化能力計算公式：

1、以自由基清除率表示：

ABTS 自由基清除率（％）=（A 空白-A 測定）÷A 空白×100％

2、以標準曲線上獲得的抗氧化劑 Trolox 的量表示：

標準曲線：y = 0.7021x - 0.0012                R2 = 0.9985                 x:Trolox 濃度(μmol/mL)

y:吸光值差值△A

單位定義:以標準曲線上獲得的抗氧化劑 Trolox 的量來表示樣本的 ABTS 自由基清除能力。（1）按樣本質量計算

總抗氧化能力（μmol Trolox/g 鮮重）=（△A+0.0012）÷0.7021×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W) =1.424×（△A+0.0012）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

總抗氧化能力（μmol Trolox/mg prot）=（△A+0.0012）÷0.7021×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×Cpr) =1.424×（△A+0.0012）÷Cpr

(3)   按細胞計算

總抗氧化能力（μmol Trolox/104cell）=（△A+0.0012）÷0.7021×V 樣÷（V 樣÷V 樣總×細胞

數量（萬個））

= 1.424×（△A+0.0012）÷ 細胞數量（萬個）

（3）按液體體積計算

總抗氧化能力（μmol Trolox/mL）=（△A+0.0012）÷0.7021 =1.424×（△A+0.0012）

V   樣總：加入提取液體積，1 mL；V 樣：反應中樣品體積，10μL；W：樣品質量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL

注意事項：

1.        盡量避免使用在中堿性條件下呈藍色或接近藍色的試劑，否則對本試劑盒的檢測結果產生干擾。

2.        樣品中不宜添加 Tween、Triton 和 NP-40 等去垢劑和 DTT、巰基乙醇等影響氧化還原反應的還原劑。