脂質過氧化物（lipid peroxidation，LPO）含量試劑盒說明書

脂質過氧化物（lipid peroxidation，LPO）含量試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

注　意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

脂質過氧化是動植物體內活性氧(ROS)氧化生物膜的過程，脂質過氧化物（LPO）是脂質過氧化過程的產(chǎn)物，即 ROS 與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關的多不飽和脂肪酸的側鏈及核酸等大分子物質起脂質過氧化反應形成 LPO，使細胞膜的流動性和通透性發(fā)生改變,最終導致細胞結構和功能的改變。因此，LPO 常被作為機體氧化應激的一種指標，與某些疾病的病理過程，如腫瘤、化學中毒、感染、炎 癥、自身免疫疾病、動脈粥樣硬化（AS）及心腦血管疾病，以及衰老等生理過程密切相關。

測定原理：

LPO 在酸性條件下加熱，產(chǎn)生小分子終產(chǎn)物 MDA，MDA 與硫代巴bi妥酸(thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成紅色產(chǎn)物，在 535nm 有最大吸收峰。

需自備的儀器和用品：

酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配置：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 35mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 12mL×1 瓶，4℃保存。

注意事項：

臨用前注意試劑二是否wan全溶解，如未溶解，可以 70℃-90℃加熱，并振蕩以促進溶解。

LPO 提?。?/span>

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長到 535 nm。

2、在 EP 管中依次加入如下試劑

立即混勻，95℃水浴 40min 后，流水冷卻。3000g 離心 10min，吸取 200µL 上清加入 96 孔板，測定 535nm 下各管吸光值，記作 A 測定和 A 空白。ΔA=A 測定-A 空白。

　　LPO 含量計算：

用 96 孔板測定的計算公式如下

y = 0.5723x - 0.0076，R² = 0.9997，x 為標準品濃度 μmol/mL，y 為吸光度。

1、血清（漿）中 LPO 含量的計算：

LPO 含量(nmol/ mL)=（ΔA+0.0076）÷0.5723×V 標÷V 樣×1000 =1747.3×（ΔA+0.0076）

2、細菌、細胞或動物組織中 LPO 含量計算

（1）按照蛋白濃度計算

LPO 含量(nmol/ mg prot)=（ΔA+0.0076）÷0.5723×V 標÷(Cpr×V 樣)×1000 =1747.3×（ΔA+0.0076）÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質含量測定試劑盒。

（2）按照樣品質量計算

LPO 含量(nmol/g 鮮重)=（ΔA+0.0076）÷0.5723×V 標÷(W ×V 樣÷V 樣總)×1000 =1747.3×（ΔA+0.0076）÷W

(3 ) 按照細菌或細胞密度計算：

LPO 含量(nmol/10⁴)=（ΔA+0.0076）÷0.5723×V 標÷(500×V 樣÷V 樣總)×1000

=3.495×（ΔA+0.0076）

V 標：標準曲線中加入標品體積，0.03mL；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬；1000，μmol 到 nmol 換算系數(shù)。