酪氨酸解氨酶（Tyrosine ammonilyase，TAL）試劑盒說(shuō)明書

酪氨酸解氨酶（Tyrosine ammonilyase，TAL）試劑盒說(shuō)明書

                                          微量法100管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：                           

TAL廣泛存在于植物和微生物中，是苯丙氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶之一。TAL能夠躍過(guò)肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）直接將酪氨酸轉(zhuǎn)化為香豆酸，香豆酸可進(jìn)一步生成白藜蘆醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素類天然產(chǎn)物。

測(cè)定原理：

TAL能夠分解酪氨酸產(chǎn)生香豆酸，使反應(yīng)溶液333nm下的吸光度隨反應(yīng)時(shí)間而上升，根據(jù)吸光度的變化率可計(jì)算出TAL活性。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板（UV板）、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存；

試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）果汁等液體樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、  酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至333nm。

2、   準(zhǔn)備96孔UV板一塊（非普通酶標(biāo)板，普通酶標(biāo)板只能透過(guò)可見(jiàn)光，不能透過(guò)紫外光，檢測(cè)波長(zhǎng)小于340nm務(wù)必使用UV板）。

3、   試劑二的配置：臨用前在試劑二瓶中加入10mL試劑一充分溶解待用（用不完的試劑4℃保存一周，注意現(xiàn)配現(xiàn)用），在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴10min以上。

4、在EP管中依次加入如下試劑

混勻，10000g 4℃離心5min，取200μL上清至96孔UV板，333nm下測(cè)定吸光值A測(cè)定與A對(duì)照，ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照

TAL活性計(jì)算：

1、血清（漿）或果汁TAL活性

單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應(yīng)體系中使333nm處吸光值變化

0.005為一個(gè)酶活力單位。

TAL（U/mL）=ΔA×V反總÷( V樣÷V樣總)÷0.005÷T =35×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞TAL活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中使333nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位。

TAL（U/mg prot）=ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.005÷T =35×ΔA÷Cpr

此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應(yīng)體系中使333nm處吸光值變化0.005為一個(gè)

酶活力單位。

TAL（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.005÷T =35×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每分鐘每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中使333nm處吸光值變化0.005為一個(gè)酶活力單位。

TAL（U/10⁴ cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.005÷T =0.07×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.42mL；V樣：加入樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬(wàn)。