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果糖-1,6-二磷酸（Fructose-1,6 Diphosphate，FDP）試劑盒說明書
微量法100T/96S
注 意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
果糖1,6-二磷酸是機(jī)體內(nèi)的高能代謝物和代謝調(diào)控劑，是糖酵解途徑的重要中間體，廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)，能影響細(xì)胞內(nèi)鉀離子的濃度，改善葡萄糖和其他能量底物的代謝，促進(jìn)組織氧的釋放，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)藥制劑。
測定原理：
醛縮酶催化果糖1,6-二磷酸降解，產(chǎn)物與DNPH縮合成紫紅色物質(zhì)，在540nm有特征吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
天平、低溫離心機(jī)、研缽、恒溫水浴鍋、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板。
試劑組成和配制：
試劑一：液體110mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體0.4mL×1支，4℃避光保存。
試劑三：液體4mL×1瓶，4℃避光保存。
試劑四：液體16mL×1瓶，4℃保存。
樣品處理：
1. 組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清待測。
2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清待測。
3. 液體：直接檢測。
測定操作：
對照管 | 測定管 | |
樣品（μL） | 20 | |
蒸餾水（μL） | 20 | |
試劑一（μL） | 44 | 40 |
試劑二（μL） | 4 | |
充分混勻，37℃反應(yīng)30min | ||
試劑三（μL） | 40 | 40 |
充分混勻，37℃溫育10min | ||
試劑四（μL） | 160 | 160 |
充分混勻，于37℃溫育10min，于微量石英比色皿/96孔板，蒸餾水調(diào)零，測定540nm處吸光值，記為A對照管和A測定管，△A=A測定管- A對照管，對照管只要做一管。 | ||
計算公式：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 0.6971x+0.0012，R2=0.9983
1．按照質(zhì)量計算
FDP（mg/g 鮮重）= (△A-0.0012) ÷0.6971÷（W÷V樣總）
= 1.43×(△A-0.0012)÷W
2．按照細(xì)胞數(shù)量計算
FDP（mg/104 cell）= (△A-0.0012) ÷0.6971÷（細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）
=1.43×(△A-0.0012)÷細(xì)胞數(shù)量
3．按照液體體積計算
FDP（mg/mL）= (△A-0.0012) ÷0.6971
= 1.43×(△A-0.0012)
W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL
b. 用96孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y= 0.3486x+0.0012，R2=0.9983
1．按照質(zhì)量計算
FDP（mg/g 鮮重）= (△A-0.0012) ÷0.3486÷（W÷V樣總）
= 2.87×(△A-0.0012)÷W
2．按照細(xì)胞數(shù)量計算
FDP（mg/104 cell）= (△A-0.0012) ÷0.3486÷（細(xì)胞數(shù)量÷V樣總）
= 2.87×(△A-0.0012)÷細(xì)胞數(shù)量
3．按照液體體積計算
FDP（mg/mL）= (△A-0.0012) ÷0.3486
= 2.87×(△A-0.0012)
W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體積，1mL
注意事項(xiàng)：
Z低檢出限為1.72 mg/L。
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