土壤谷氨酰胺酶(solid-glutaminase, S- GLS) 活性測定試劑盒說明書

土壤谷氨酰胺酶(solid-glutaminase, S- GLS) 活性測定試劑盒說明書

                                            微量法 100管/96樣

注    意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

GLS（EC 3.5.1.2）存在于高等動物和某些細(xì)菌以及植物根中，催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用，尤其是調(diào)節(jié)游離氨含量和尿素代謝。

測定原理：

S-GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏試劑檢測氨增加的速率，即可計算其酶活性。

需自備儀器和用品：

臺式離心機、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、甲苯、冰和雙蒸水。

試劑組成和配制：

試劑一×1瓶，15 mL，4 ℃保存；

試劑二×1瓶，40 mL，4 ℃保存；

試劑三×1瓶，60 mL，常溫保存；

試劑四×1瓶，5 mL，常溫保存；

試劑五×1瓶，3 mL，常溫保存；

試劑六×1瓶，3 mL，常溫避光保存。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至420nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣品測定（在EP管中加入下列試劑）：

混勻，37℃水浴2 小時

混勻，8000 g，25℃離心10 min；取上清液，依次加入下列試劑

混勻，室溫靜置15min，420nm處讀取測定管和對照管吸光值，

計算ΔA=A測定管-A對照管。對照管只要做一管。

注意：試劑六如出現(xiàn)沉淀，靜置后取上清使用。

酶活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 3.8488x+0.0057；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值A。

單位定義：每g土樣每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

 S-GLS（nmol/min/g 土樣）＝(ΔA-0.0057)÷3.8488×V反總÷W÷T=2.27×(ΔA -0.0057)÷W。

V反總：反應(yīng)體系總體積：1.05mL；T：反應(yīng)時間，2h=120min；W：樣本質(zhì)量，g; 1000，μmol到nmol換算系數(shù)。

b.用96孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y = 1.9244x+0.0057；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為吸光值A。

單位定義：每g土樣每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

 S-GLS（nmol/min/g 土樣）＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷W÷T=4.55×(ΔA -0.0057)÷W。

V反總：反應(yīng)體系總體積：0.525mL；T：反應(yīng)時間，2h=120min；W：樣本質(zhì)量，g; 1000，μmol到nmol換算系數(shù)。