乙醇酸氧化酶（glycollic oxidase, GO）試劑盒說(shuō)明書(shū)

乙醇酸氧化酶（glycollic oxidase, GO）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

乙醇酸氧化酶（EC1.1.3.1）是植物光呼吸代謝中的關(guān)鍵酶，也是光下合成草酸的關(guān)鍵酶，它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，對(duì)研究光呼吸代謝過(guò)程及其調(diào)控具有重要意義。

測(cè)定原理：

乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸和鹽酸苯肼反應(yīng)生成乙醛酸苯腙，在324nm有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體15mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存，臨用前加5mL雙蒸水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：液體2mL×1支，4℃保存。

酶液提?。?/p>

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。12000g， 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定操作表：

酶活性計(jì)算公式：

a．用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

GO活性（nmol/min /mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 392×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

GO活性（nmol/min /g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 392×△A÷W

ε：乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數(shù)：17L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，3min

b. 用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

GO活性（nmol/min /mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 784×△A÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

GO活性（nmol/min /g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 784×△A÷W

ε：乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數(shù)：17L/mmol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，3min