乙醇脫氫酶（ADH）活性測定試劑盒說明書

乙醇脫氫酶（ADH）活性測定試劑盒說明書

                                             微量法 100T/96S

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉換，在很多生理過程中起著重要作用。哺乳動物ADH主要在肝臟生成，肝臟損傷導致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。

測定原理：

ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD⁺，NADH在340nm處有吸收峰，而NAD⁺沒有；測定340nm 吸光度下降速率，來計算ADH活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，室溫保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。              

試劑三：粉劑×2瓶，－20℃保存，臨用前每瓶加入9mL試劑二，現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑四：液體×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

1、   組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。16000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。

2、   細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；16000g， 4℃離心20min，取上清液置冰上待測。

3、血清等液體：直接測定。

ADH測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min，調節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑三在25℃水浴中保溫30 min。

3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL樣本上清液、160μL試劑三和20μL試劑四，迅速混勻后于340nm測定吸光值變化，分別記錄15s和75s時吸光值，分別記為A1和A2。△A測定管=A1-A2。

計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷(Cpr×V樣)÷T

=1608×△A ÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

ADH (nmol/min/g 鮮重) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A ÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中每10⁴個細胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

ADH (nmol/min/10⁴cell) = (△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A ÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷V樣÷T

=1608×△A

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應體系總體積，200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W ：樣品質量；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應時間，1min。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷(Cpr×V樣)÷T

=3215×△A÷Cpr

（2）按照樣本質量計算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

ADH (nmol/min/g 鮮重) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=3215×△A÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中每10⁴個細胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

ADH (nmol/min/10⁴cell) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=3215×△A÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。

ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷V樣÷T

=3215×△A

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應體系總體積，200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/mL；W ：樣品質量；V樣：加入反應體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應時間，1min。