胰蛋白酶（Trypsin）試劑盒說明書

胰蛋白酶（Trypsin）試劑盒說明書

                                         微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：                          

胰蛋白酶選擇性水解變性蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，是一種重要的消化酶。此外，胰蛋白酶還廣泛應(yīng)用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等的輔助治療。

測(cè)定原理：

胰蛋白酶催化水解TAME的酯鍵，釋放出的游離羧基與反應(yīng)體系中的氫氧化鈉發(fā)生中和反應(yīng)，導(dǎo)致溶液的pH值降低，以苯酚紅為指示劑，測(cè)定溶液在555nm處吸收值的變化，可以快速測(cè)得胰蛋白酶活性數(shù)據(jù)。胰蛋白酶在一定范圍內(nèi)與555nm處吸收值的降低呈良好的線性關(guān)系。

自備儀器和用品：

酶標(biāo)儀、96孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體120 mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體5 mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體5 mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體2 mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1. 組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）冰浴勻漿，10000g，4℃離心10min，取上清，即粗酶液。

測(cè)定步驟：

1. 酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到555 nm。

2. 工作液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：蒸餾水（V）：試劑三（V）=1 mL：1 mL：5.4 mL：0.4 mL的比例充分混合。（注意：現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，在空瓶中配制，試劑盒中帶有4個(gè)空瓶）

3. 吸取5μL樣本，加入195 μL工作液，混勻后立即測(cè)定，記錄555nm下1min時(shí)的吸光值A1和2min時(shí)的吸光值A2。計(jì)算△A=A1-A2

注意：如果△A小于0.005，可將反應(yīng)時(shí)間延長到5min。如果△A大于0.5，體系迅速變色，可將樣本用提取液稀釋后測(cè)定（建議稀釋10倍），計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

胰蛋白酶活性計(jì)算公式：

使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：室溫下每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化555nm處吸光值減少0.5為1個(gè)酶活單位。

胰蛋白酶（U/mg prot）= △A ×V反總 ÷（Cpr×V1）÷0.5÷T

=80×△A ÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：室溫每克組織每分鐘催化555nm處吸光值減少0.5為1個(gè)酶活單位。

胰蛋白酶（U/g 鮮重）= △A×V反總÷（W×V1÷V2）÷0.5÷T

=80×△A ÷W

Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定；W：組織質(zhì)量（g）；V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（mL），5 μL=0.005 mL；V2：粗酶液總體積（mL），1 mL；V反總：反應(yīng)總體積，0.2 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），1 min。