魚類神經(jīng)壞死病毒(VNN)核酸檢測(cè)試劑盒說明書

魚類神經(jīng)壞死病毒(VNN)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)

 【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：魚類神經(jīng)壞死病毒(VNN)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)

Name ：Viral Nervous Necrosis Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

魚病毒性神經(jīng)壞死病又稱為病毒性腦病和視網(wǎng)膜病，是一種嚴(yán)重危害魚類魚苗的病毒性疾病。病原為病毒性神經(jīng)壞死病毒（Viral nervous necrosis virus, VNNV）,屬乙型野田村病毒屬成員[1]。其臨床癥狀為一系列與神經(jīng)有關(guān)的異常表現(xiàn)。魚苗具不正常的螺旋狀或旋轉(zhuǎn)式游動(dòng)或靜止時(shí)腹部朝上，一旦用手觸碰病魚，病魚會(huì)立即游動(dòng)等現(xiàn)象，魚體體色異常蒼白。不同種類的魚臨床癥狀不同，有的魚苗會(huì)出現(xiàn)鰾過度膨脹，有的病魚厭食、消瘦等。發(fā)病嚴(yán)重的魚苗伴隨著ji高的死亡率[1-2]。

本試劑盒適用于檢測(cè)的魚的腦、眼等標(biāo)本中魚類神經(jīng)壞死病毒 RNA，適用于魚類神經(jīng)壞死病毒感染的輔助診斷。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒對(duì)魚類神經(jīng)壞死病毒基因設(shè)計(jì)特異性的引物和探針[2-3]，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)魚類神經(jīng)壞死病毒RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

注：

1）  不同批號(hào)試劑不能混用。

2）  試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列

熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

取魚類的腦和眼，魚苗和較小的仔魚取整條魚。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過 6 個(gè)月，標(biāo)

本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.  樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1  樣本前處理

每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中， 8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2  RNA 提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），

請(qǐng)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.  試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照；反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.  加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.  PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1  將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2  設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇：

檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3  推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線；

可疑：檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤ 38，且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.  質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

7.  檢測(cè)方法的局限性

? 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

? 陽性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；

? 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，wan全混勻并短暫離心；

? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

? 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；

? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全   通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 陳愛平, 江育林, 錢冬, 等. 病毒性神經(jīng)壞死病[J]. 中國(guó)水產(chǎn), 2010.

[2] 中國(guó)農(nóng)業(yè)部. SC/T 7216-2012 魚類病毒性神經(jīng)壞死病(VNN)診斷技術(shù)規(guī)程[S]. [3]羅衛(wèi). 魚類病毒性神經(jīng)壞死病的病原學(xué)研究及檢測(cè)方法的建立[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.