轉(zhuǎn)基因植物NOS 終止子核酸檢測試劑盒說明書

轉(zhuǎn)基因植物NOS 終止子核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：轉(zhuǎn)基因植物 NOS 終止子核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法) 

Name ：tNOS Gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】

根農(nóng)桿菌煙脂堿合成酶基因終止子（tNOS）是轉(zhuǎn)基因作物常用到的元件之一，   到目前為止，43%的轉(zhuǎn)基因作物含有 NOS 終止子。熒光 PCR 技術(shù)因其靈敏度高、特異性強等特點，在轉(zhuǎn)基因檢測中發(fā)揮了重要作用。

本試劑盒適用于檢測轉(zhuǎn)基因植物的 NOS 終止子基因，用于篩查待檢測植物中是否含有 NOS 成分。。

【檢驗原理】

本試劑盒根據(jù) NOS 終止子序列設計特異性引物和探針[1-3]，用熒光 PCR 技術(shù)進行轉(zhuǎn)基因成分的檢測。

【試劑組成】

注：

1）  不同批號試劑不能混用。

2）  試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃避光保存、運輸、反復凍融不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

稱取 200g 樣品。

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 0℃冰壺。

【使用方法】

1.  樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1  樣本前處理

固體樣本：用粉碎機或冷凍研磨儀將樣品研磨至細粉狀。

1.2  DNA 提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑盒（離心柱提取

法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2.  試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，21uL/管。

3.  加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.  PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25ul；熒光通道選擇： 檢測通道

（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：

5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值

≤38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.  質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

7.  檢測方法的局限性

? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

? 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或   定量檢測不準確的結(jié)果；

? 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

? 所有操作嚴格按照說明書進行；

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，wan全混勻并短暫離心；

? 反應液應避光保存；

? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全   通則》進行處理。.

【參考文獻】

[1]  中國農(nóng)業(yè)部. 1782 號公告-3-2012 轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測調(diào)控元件CamV 35S 啟動子、FMV 35S 啟動子、NOS 啟動子、NOS 終止子和 CaMV 35S 終止子定性 PCR 方法[S]. 北京: 科學出版社, 2012.

[2] 徐俊鋒, 王鵬飛, 李玥瑩, 等. 轉(zhuǎn)基因植物中CaMV35S 和tNOS 元件的 4 種定性PCR 檢測方法的比較. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報, 2015 , 23 (3) :397-407.

[3] 周建嫦, 楊明杰, 楊杏芬. PCR 法檢測食品和動物飼料中的轉(zhuǎn)基因成分[J]. 衛(wèi)生研究, 2005 , 34 (6) :732-735.